ראשוני הקיבוץ חברי תנועת 'ברית חלוצים דתיים' (בח"ד)  שעלו מגרמניה, לאחר השתלמות בחוות הכשרה, והתרכזו ברודגס ליד פתח תקווה. ב-20 ביולי 1935 נשלחה פלוגת עבודה שמנתה 14 חלוצים מרודגס למגד שליד פרדס חנה. בשנת 1936 עברו החברים למחנה קבע והקימו את קבוצת 'רמת השומרון'.  אל הראשונים הצטרפו יוצאי 'החלוץ המזרחי' מצ'כיה, קבוצת 'ירושלים' של בח"ד מגרמניה, בוגרי חברות נוער מכפר פינס וממקווה ישראל וקבוצת מעפילים מניצולי 'פטריה'.

ב-28 בינואר 1943 עלתה קבוצת חלוץ על הקרקע בנגב הצפוני מערבי בסמוך לעזה. חברי הקבוצה החלו לעבד את הקרקעות ולהקים את מבני הקיבוץ. הוחלט לקרוא לישוב בשם 'בארות יצחק'  על שם הרב יצחק ניסנבוים, ממייסדי 'המזרחי' ומראשי התנועה הציונית דתית בפולין, אשר נספה בשואה. בשנת 1945 החלה בנית מבני הקבע ובשנת 1946 הושלמה העברת הקיבוץ מפרדס חנה לנגב. באותה שנה הצטרפה לקיבוץ קבוצת 'במישור' שחבריה הגיעו לארץ מאירופה כמעפילים.

לפני הקמת המדינה היה במקום בסיס של הפלמ"ח. ביוני 1946 ב'ליל הגשרים' צאה מהקיבוץ החוליה שפוצצה את גשר עזה.  יצאו באוקטובר 1946 במבצע הקמת 11 הישובים בנגב יצאו מבארות יצחק הקבוצות  שהקימו את הישובים כפר דרום, בארי ותקומה. במלחמת העצמאות הופגז הקיבוץ במשך 27 ימים רצופים על ידי הצבא המצרי והותקף פעמים אחדות, כשבאחת מהן אף נכבש חלק מהקיבוץ. המגינים, חברי הקיבוץ בסיוע לוחמי חטיבת הנגב, הצליחו להדוף את התוקפים, אולם היישוב נחרב כליל ולמגינים נגרמו אבידות כבדות.

בשנת 1949 עברו חברי הקיבוץ למושבה הגרמנית הנטושה וילהלמה שבשפלת לוד. בשנת 1950 החלו לבנות את בארות יצחק החדש. ובשנת 1952 הושלם המעבר לנקודה החדשה. בשנת 1956 הצטרף לקיבוץ גרעין 'מתנחלים' מתנועת 'בני עקיבא'. בשנת 1975 הצטרף גרעין 'מתיתיהו' של עולים מארצות הברית.