ב-5 בינואר 1930 התאחדו מפלגות 'אחדות העבודה' ו'הפועל הצעיר' והקימו את מפא"י. בשנת 1932 התאחדו הבריתות העולמיות הקשורות אליהן, 'הברית העולמית של פועלי ציון ימין' ו'התאחדות' והקימו את 'האיחוד העולמי' הקשור למפא"י. האיחוד התבצע לאחר תקופה ממושכת של התקרבות בין המפלגות. מנהיגי שתי המפלגות היו למנהיגי מפא"י: דוד בן-גוריון, יצחק בן-צבי, שמואל יבנאלי, ברל כצנלסון, דוד רמז ומשה שרת מ'אחדות העבודה'; יוסף אהרונוביץ, חיים ארלוזורוב, אליעזר קפלן ויוסף שפרינצק מ'הפועל הצעיר'.
למרות שבעת הקמתה מנתה מפא"י 5,000 חברים בלבד, הפכה המפלגה החדשה במהרה לכח הפוליטי הדומיננטי והמרכזי ביותר בתנועת הפועלים הארצישראלית, בהסתדרות הכללית, בישוב היהודי ובהסתדרות הציונית העולמית, ועל מעמד זה היא שמרה כל ימיה. מפא"י, באמצעות נציגיה, הנהיגה את המוסדות החברתיים, הכלכליים, הבטחוניים, התרבותיים וההתיישבותיים של היישוב. שלוש תנועות התישבותיות היו מזוהות עם מפא"י: 'הקיבוץ המאוחד', 'חבר הקבוצות' ותנועת המושבים. מפא"י מילאה תפקיד מרכזי בייזום, ניהול ותכנון ההתיישבות היהודית בארץ; בארגון מוסדות ההגנה של היישוב; בארגונם של בני נוער במסגרת ההכשרות הציוניות בגולה; בהעלאתם של אלפי יהודים ארצה במסגרת ההעפלה; בניהול המדיניות הציונית כלפי הבריטים ובתחומים רבים נוספים.
עקרונות היסוד של מפא"י היו: הגשמה ציונית-סוציאליסטית
בארץ ישראל, תוך הדגשת ההתישבות החקלאית; עידוד העליה, בעיקר החלוצית; הגנה
על העובדים היהודים בארץ ישראל; הרחבת פעילותה המשקית של ההסתדרות הכללית;
שיתוף פעולה עם מפלגות סוציאל דמוקרטיות. מפא"י דגלה ב'סוציאליזם קונסטרוקטיבי' - גישה סוציאליסטית פרגמטית שהתבטאה בחתירה להשגת יעדים לאומיים ומעמדיים בעת ובעונה אחת. הגישה מתבטאת בסיסמתו של דוד בן-גוריון 'ממעמד לעם' ובדבריו של ברל כצנלסון, 'אין מעמד הפועלים גואל עצמו, אלא אם כן האומה כולה נגאלת עמו'. גישתה של מפא"י לא היתה מרקסיסטית, עם זאת היו במפלגה גם בעלי תפיסות סוציאליסטיות מרקסיסטיות, כגון אנשי 'הקיבוץ המאוחד'. לשם השגת מטרותיה שיתפה מפא"י פעולה גם עם כוחות שאינם שייכים
למחנה הפועלים, כגון המעמד הבינוני והציונות הדתית.
בשנות ה-30 ניהלה מפא"י מאבק על ההגמוניה בישוב ובתנועה הציונית עם התנועה הרוויזיוניסטית. רצח ארלוזורוב בשנת 1933 וחילוקי הדיעות בנודע ל'הסכם ההעברה' החריפו את היחסים בין המפלגות. פרישת הרוויזיוניסטים מההסתדרות הציונית העולמית בשנת 1935 חיזקה את מפא"י במסגרות הציוניות ובסוכנות היהודית. באותה שנה נבחר בן-גוריון ליו"ר הנהלת הסוכנות היהודית, שימש בתפקיד זה עד 1948 והיה לדוברו הראשי של הישוב. במקביל המשיכה מפא"י להנהיג את ההסתדרות (לאחר פרישת בן-גוריון מהנהגתה, עמדו בראשה דוד רמז ויוסף שפרינצק), את הוועד הלאומי (בראשות יצחק בן-צבי ודוד רמז) ואת ה'הגנה' (בהנהגת אליהו גולומב ואחרים). בשנת 1937, כשהעלתה בריטניה את תוכנית החלוקה, היו הדיעות במפא"י בנושא חלוקות.
במלחמת העולם השניה תמכה מפא"י בהתנדבות לצבא הבריטי במסגרת המאבק בנאצים ומיתנה את התנגדותה לממשלת המנדט, למרות המשך ישום מדיניות 'הספר הלבן'. כשהגיעו הידיעות על השמדת היהודים על ידי הנאצים, ניסתה מפא"י בעזרת ארגונים יהודיים בינלאומיים לגרום לבעלות הברית לפעול להצלת יהודי אירופה.
במהלך המלחמה, התגבשה במפא"י אופוזיציה של אנשי 'סיעה ב'', אשר שכללה בעיקר את אנשי 'הקיבוץ המאוחד' וחברים מסניף תל-אביב. 'סיעה ב'' התאפיינה בהתנגדות לתוכנית בילטמור, בביקורת על הסוציאליזם המתון של מפא"י, בהערצה לברית המועצות ובביקורת על הבירוקרטיזציה של ההסתדרות. בשנת 1944, פרשו אנשי הסיעה ממפא"י והקימו את 'התנועה לאחדות העבודה' בראשותם של יצחק טבנקין, ישראל גלילי וישראל בר-יהודה. בעקבות הפילוג ירד כוחה של מפא"י בהסתדרות (מ-70% ל-54%), אך נשמר מעמדה הבכיר בהסתדרות, באסיפת הנבחרים ובסוכנות היהודית. בעקבות הפילוג הוקמה בתוך מפא"י 'סיעה ג'', שהשתלטה, מתוך נאמנות לבן-גוריון, על המנגנון המפלגתי וממנה התפתח בהמשך 'הגוש'.
בתקופת המאבק בשלטון הבריטי בשנים 1948-1945 שררו במפלגה חילוקי דיעות בנוגע לאופי המאבק ולדחיפות בהקמת מדינה. 'האקטיביסטים' (בהם בן-גוריון, גולדה מאיר, שאול אביגור, לוי אשכול ואליעזר ליבנה) תמכו במאבק מזוין ובהגברת ההעפלה. 'המתונים' (בהם אליעזר קפלן, יוסף שפרינצק, קדיש לוז ופנחס לבון) התנגדו למאבק המזוין ולא ראו דחיפות בהקמת המדינה. שרת, רמז וזלמן ארן תמכו בפשרה בין העמדות השונות. בוועידת מפא"י בספטמבר 1946 זכתה העמדה הראשונה ברוב. ב-12 במאי 1948, החליט מרכז המפלגה לתמוך בהכרזת העצמאות.
לאחר קום המדינה היתה מפא"י למפלגת השלטון - למפלגה המרכזית במדינה והמכריעה במרבית הענינים. במועצת העם היו למפא"י 10 מושבים מתוך 37. בבחירות לכנסת היתה מפא"י המפלגה הגדולה ביותר ומספר המנדטים שלה (47-40 בחמש הכנסות הראשונות) היה כפול ויותר ממספר המנדטים של המפלגה השניה בגודלה. מפא"י הרכיבה את כל הממשלות ואנשיה החזיקו תמיד בתפקידי ראש הממשלה, ובתיקי הביטחון (עד 1967), האוצר, החינוך, החוץ והמשטרה. בהנהגתו של בן-גוריון הובילה המפלגה מדיניות ממלכתית שמיקמה אותה
כמפלגת מרכז, וקבעה את שותפותיה לקואליציה (המפלגות הדתיות והליברליות ולא מפ"ם, נציגת האגף השמאלי בתנועת הפועלים). גם פעילותן של המסגרות הפרטיות והוולונטריות, שניהלו בתקופת המנדט את עניני הישוב (בתחומי החינוך, העבודה, הבטחון וכו'), הועברה למסגרות ממלכתיות, המנוהלות בידי הממשלה, מתוך ראיית צורכי המדינה ככלל.
מפא"י המשיכה להיות הכח הקובע בהסתדרות הכללית ובסוכנות היהודית ונציגיה החזיקו בתפקידים הבכירים. מפא"י התחזקה מאד גם ברשויות המקומיות ואנשיה כיהנו כראשי הערים הגדולות. רוב העמדות הבכירות במערכת הממלכתית ובמשק הציבורי נתפסו על ידי אנשי מפא"י. בשנת 1967, ערב המיזוג עם 'אחדות העבודה-פועלי ציון' ורפ"י, מנתה מפא"י 160,000 חברים. חבריה ואוהדיה של המפלגה נמנו עם כל שכבות העם: פועלים עירוניים, כפריים וחקלאיים; ותיקים ועולים חדשים; בעלי מקצועות חפשיים, אינטלקטואלים, פקידים ומנהלים; סוחרים, בעלי עסקים ותעשיינים.
מפא"י קיבלה בבחירות לכנסות השונות 32%-38% מהקולות. אולם, מקומה המרכזי בממשלה ואישיותו הבולטת של בן-גוריון גרמו לזיהויה עם הממשלה. עמדות השליטה שלה הפכו את מפא"י לגורם הקובע במינוי הפקידות הבכירה, הן ברשויות הממשלתיות והציבוריות והן במפעלים המשקיים הקשורים אליהן. כוחו של המנגנון במפא"י גדל, ומסלול ההתקדמות בתנועה עבר בשכבה זאת של פקידים-עסקנים שהחזיקו בעמדות הכח. הצד השלילי בעוצמתה של מפא"י התבטא בהעדפת אנשי המפלגה במוסדות השלטון, ובהשלטת המנגנון המפלגתי על מוסדות שלא היו מפלגתיים באופיים.
בשנת 1966 נוסחו מחדש מטרותיה של מפא"י והן: חתירה לקיבוץ גלויות; פיתוח הארץ וישובה; פיתוח כלכלי מתוכנן ועידוד כל יוזמה קונסטרוקטיבית, ציבורית ופרטית; התקדמות המבוססת על עקרונות סוציאל-דמוקרטיים; שלום עם מדינות ערב על בסיס השלמות הטריטוריאלית של מדינות המזרח התיכון; יחסי ידידות עם כל האומות ושיתוף פעולה עם המדינות המתפתחות.
בספטמבר 1960 החל במפא"י משבר קשה וממושך על רקע פרשת לבון ובן-גוריון נאלץ להתמודד עם אופוזיציה חזקה במפלגתו. בעקבות הלחצים של בן-גוריון הודח לבון מראשות ההסתדרות ובן-גוריון הנהיג את מפא"י בבחירות לכנסת באוגוסט 1961. נדמה היה שהפרשה שככה, אולם בשנת 1964 היא התעוררה מחדש עקב דרישתו של בן-גוריון (שכבר פרש מראשות הממשלה) למנות ועדת חקירה משפטית לבדיקת הפרשה. המאבק במפא"י סביב דרישה זאת השתלב במאבק במפלגה בין הצמרת הוותיקה (אשכול, שרת, פנחס ספיר, מאיר, ארן), שהתנגדה לדרישה, לבין 'צעירי מפא"י' (משה דיין, שמעון פרס, טדי קולק), שהיו מקורבים רעיונית לבן-גוריון. במאבק השתקפו חילוקי דיעות בענייני ממלכתיות, ההסתדרות הכללית, היחס ליזמה הפרטית ועוד.
בפברואר 1965 בוועידת מפא"י התקבלו דרישותיו של אשכול שלא להקים ועדת חקירה משפטית ולהקים את 'המערך לאחדות פועלי ישראל'' יחד עם 'אחדות העבודה-פועלי ציון'. עקב כך פרשו ביוני 1965 בן-גוריון ותומכיו ממפא"י והקימו את 'רשימת פועלי ישראל' (רפ"י). בבחירות להסתדרות בספטמבר 1965 זכה 'המערך' ברוב של 51%, ואילו בבחירות לכנסת ה-6 בנובמבר 1965 קיבל 'המערך' 45 מנדטים (רפ"י קיבלה 10 מנדטים בלבד).
במסגרת 'המערך' התקרבו מפא"י ו'אחדות העבודה-פועלי ציון' זו לזו בעוד שרפ"י נותרה באופוזיציה. ערב מלחמת ששת הימים, עקב לחץ ציבורי, צורפה רפ"י לממשלה ותיק הביטחון הועבר מאשכול לדיין. לאחר המלחמה התחזקה הנטיה ברפ"י לשוב ולהתאחד עם מפא"י. גם צמרת מפא"י היתה מעונינת באיחוד זה. בינואר 1968 התאחדו מפא"י, 'אחדות העבודה-פועלי ציון' ורפ"י והקימו את מפלגת העבודה הישראלית. המיעוט ברפ"י, ובכללו בן-גוריון, שהתנגד לאיחוד פרש והקים את 'הרשימה הממלכתית'. מפ"ם לא הצטרפה לאיחוד של המפלגות הסוציאליסטיות במסגרת מפלגת העבודה, אולם שיתפה עימו פעולה במסגרת 'המערך' בבחירות לכנסת באותה שנה. 'המערך' זכה ב-56 מנדטים ואילו 'הרשימה הממלכתית' ב-4 מנדטים. יוצאי מפא"י במפלגת העבודה המשיכו במשך שנים לפעול בתוך המפלגה במסגרת 'חטיבת מפא"י', הגדולה מבין שלוש חטיבות המפלגה, ולהחזיק ברוב העמדות הבכירות.
המבנה אירגוני של המפלגה התבסס על מוסדות נבחרים:
ועידה (שהתכנסה אחת לכמה שנים), מועצה (שהתכנסה מדי שנה, מוסד זה בוטל כעבור
זמן), מרכז (שהתכנס כמה פעמים בשנה) ומזכירות (שהתכנסה פעמיים-שלוש בחודש).
בפועל הונהגה המפלגה על ידי גוף לא פורמלי בשם 'חברינו', שכלל את כל שרי המפלגה, את
מזכיר המפלגה, את מזכיר ההסתדרות ולעיתים גם את יו"ר הקואליציה. גוף זה התקיים בצורות שונות עד 'המהפך' בשנת 1977.
כל ראשי הממשלה של ישראל למן קום המדינה ועד שנת 1974 היו חברי מפא"י: דוד בן-גוריון, משה שרת, לוי אשכול, גולדה מאיר. נשיאי המדינה שהשתייכו למפא"י היו: יצחק בן-צבי, זלמן שזר, אפרים קציר. מאז 1930 הוציאה המפלגה לאור את השבועון 'הפועל הצעיר' וכן בטאונים נוספים בעברית ובשפות נוספות. גם היומון של ההסתדרות, 'דבר', ייצג בנאמנות, בדרך כלל, את עמדות מפא"י. בשנת 1949 הוקם בצופית המרכז הרעיוני של המפלגה, 'בית ברל', על שמו של ברל כצנלסון.